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Nature子刊慢性胰腺炎动物模型是如何开发的?

标签:慢性,胰腺,胰腺炎,动物,动物模型,模型,如何,开发  2019-1-24 13:19:04  预览

  

胰腺炎是由于胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病奥林巴斯显微镜,包括急性胰腺炎、复发性急性胰腺炎和慢性胰腺炎。这些疾病奥林巴斯显微镜常常引起腹痛、恶心、吐逆、发热等症状,但并没有特异性疗法。

以往的研究注解,编码消化蛋白酶或其克制剂的基因若发生突变,则每每会促进急性胰腺炎的发生,并渐渐发展成慢性胰腺炎。例如河南人事考试信息网,PRSS1(阳离子胰蛋白酶原)、CTRC(胰凝乳蛋白酶C)以及SPINK1(Kazal型丝氨酸蛋白酶克制剂1)的致病奥林巴斯显微镜突变通过刺激自觉激活或干扰保护机制,从而促进胰蛋白酶原转化成有害的胰蛋白酶。

不过,基因突变引起的胰腺内胰蛋白酶原自觉激活具有直接致病奥林巴斯显微镜作用,这虽然获得了大量的遗传和生化证据支撑,但目前还缺乏适当动物模型的确认。更紧张的是,动物模型的缺乏还阻碍了胰蛋白酶克制剂的临床前试验。

为此,波士顿大学口腔医学院(Henry M. Goldman School of Dental Medicine)的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth开发出一种T7D23A基因敲入小鼠,以弥补此领域的空白。这种小鼠携带阳离子胰蛋白酶原(T7亚型)的杂合p.D23A突变,为胰腺炎的研究和治疗提供了出色的模型。这项成果近日发表在《Nature Communications》上。

T7D23A基因敲入小鼠的开发

小鼠基因组包含20个胰蛋白酶原基因。之前的研究注解,只有四种胰蛋白酶原高水平表达,它们分别是:T7、T8、T9和T209亚型。其中,T7亚型占胰蛋白酶原总量的40-50%,并且与其他亚型相比自觉激活更快,产生的胰蛋白酶水平也更高。

为了产生自觉激活增长的T7突变体,研究人员在激活肽中引入了Ala突变,以庖代Asp23(p.D23A)。为了在体外测试T7 p.D23A突变体的激活特征,他们纯化了重组野生型和突变型T7胰蛋白酶原,并测定了自觉激活。与野生型相比,p.D23A突变体的自觉激活明显增长了50倍,同时,其他胰蛋白酶激活和降解途径不受影响。

之后,研究人员委托赛业生物(Cyagen)制备了T7D23A基因敲入小鼠,详细是通过C57BL/6胚胎干细胞奥林巴斯显微镜中的同源重组将p.D23A突变引入小鼠基因组(图1)。DNA测序注解,这些杂合小鼠在突变位点表现出两个高度相称的峰,注解野生型和突变型等位基因的表达水平相称。新的T7D23A品系未出现显明的表型改变,并且正常滋生。

 
图1. p.D23A突变对胰蛋白酶原T7亚型的影响。

T7D23A小鼠出现自觉的急性和慢性胰腺炎

研究人员对T7D23A小鼠的胰腺形态进行观察,发现2-3周时是正常的,但4-5周时转变较大,而2个月后胰腺显明变小。组织学检测发现,T7D23A小鼠从第3周开始出现典型的急性胰腺炎,在4-5周出现得更加频繁(~40%)。水肿破坏了紧密排列的组织结构,大量炎性细胞奥林巴斯显微镜浸润,且小叶出现中心局部坏死(图2)。

在4-5周时,研究人员发现超过一半的小鼠体现出显明的疾病奥林巴斯显微镜进展。它们的胰腺切片表现出广泛的再生指征南京设计,包括假管复合物出现、胰管扩张和弥漫性间质纤维化,这些都是早期慢性胰腺炎的特性。从2个月开始并持续到6至12个月,脂肪开始在组织学图像中占有主导地位,而炎性细胞奥林巴斯显微镜和假管复合物的数量开始削减。在扩张胰管的四周纤维化更普遍,偶然还充满嗜酸性物质,这些是晚期慢性胰腺炎的特性。

 
图2. T7D23A小鼠的胰腺组织学。

之后,研究人员将T7D23A小鼠的胰腺重量与C57BL/6N对照小鼠进行比较,发现约40%的小鼠在4-5周龄体现出显明增长。这种增长与组织切片上观察到的水肿性急性胰腺炎同等。大约50%的小鼠在4-5周龄时胰腺重量显明减轻,注解早期慢性胰腺炎的出现。所有T7D23A小鼠在2月、6月和12月龄时表现出与晚期慢性胰腺炎相关的胰腺萎缩,与对照小鼠相比胰腺重量减轻约70%。

T7D23A小鼠的酶活检测

淀粉酶是诊断急性胰腺炎最常用的指标。因此,研究人员也测定了各个年龄的T7D23A小鼠血浆中的淀粉酶活性。在4-5周时,他们在约40%的小鼠中观察到淀粉酶值偏高,这与之前的效果同等。不过,并非所有小鼠都能捕捉到急性胰腺炎的指标,这可能与采样时间和发病奥林巴斯显微镜年龄有关,也可能是小鼠在没有急性发作的情况下患上慢性胰腺炎。

接着,他们以3周龄(无病奥林巴斯显微镜理转变)、4周龄(急性或早期慢性胰腺炎)和2月龄(晚期慢性胰腺炎)T7D23A小鼠为对象豪沃A7驾驶室,测定了奇怪制备的胰腺匀浆液中的胰蛋白酶活性。与雷同年龄的对照小鼠相比,3周时未检测到胰蛋白酶活性的升高,但在4周时检测到高值。尽管功能性腺泡细胞奥林巴斯显微镜削减,但在2个月时仍观察到酶活的升高,注解胰腺内胰蛋白酶的激活在整个疾病奥林巴斯显微镜过程中持续存在。这些效果支撑了,胰蛋白酶原的自觉激活可引起急性胰腺炎发作,且随后发展成慢性胰腺炎。

为了排除与胰蛋白酶原自觉激活无关的疾病奥林巴斯显微镜机制,研究人员还制备了p.D23A、K24G双突变的小鼠品系,除了带有杂合的T7D23A等位基因,胰蛋白酶原激活位点Lys24也经过突变。这种小鼠在5.5个月时没有出现自觉的胰腺病奥林巴斯显微镜理转变。这个效果提供了令人佩服的证据,说明胰蛋白酶原错误折叠等机制并不引起T7D23A小鼠的表型。

T7D23A小鼠与人类胰腺炎的特性比较

研究人员认为,这种新模型概括了人类胰腺炎的临床疾病奥林巴斯显微镜特点,它总是先发展为急性胰腺炎,然后再发展为不可逆的慢性胰腺炎。不过,他们没有观察到人类经常出现的急性病奥林巴斯显微镜情反复发作。这种差异可能是由此处所用的胰蛋白酶原突变造成的。

研究人员认为百度优化,他们展示了第一个慢性胰腺炎的临床前小鼠模型,该疾病奥林巴斯显微镜是由胰腺内胰蛋白酶原自觉激活的增长所驱动的。这个模型概括了人类慢性胰腺炎的明显特性。值得一提的是,尽管T7D23A小鼠出现显明的病奥林巴斯显微镜理转变,但它们能够正常滋生并发育到成年期,这是临床前应用的先决条件。

“在概念层面,这个模型提供了直接的体内证据,注解胰蛋白酶原的自觉激活可驱动慢性胰腺炎的发作和发展,且治疗方法应针对胰腺内的胰蛋白酶,”研究人员总结道。(生物通 余亮)

原文检索

A preclinical model of chronic pancreatitis driven by trypsinogen autoactivation
Andrea Geisz & Miklós Sahin-Tóth

Nature Communications 9, Article number: 5033 (2018)